壳聚糖基皮革抗菌涂层的研究
Isabel P． Fernandes1 Joana S． Amaral2 Vera Pinto3 Maria José Ferreira3 Maria Filomena Barreiro1
( 1． 分离与反应工程实验室( LSＲE) ，副实验室LSＲE/LCM，布拉干萨理工学院，葡萄牙布拉干萨5301857; 2． 药剂学院，波尔图大学，葡萄牙，波尔图4050313 和布拉干萨理工学院，葡萄牙布拉干萨5301857; 3． 葡萄牙制鞋技术中心，葡萄牙圣若昂3700121)
现今越来越多的消费者追求卫生健康积极的生活方式，这给制鞋行业带来了不小的挑战。鞋和脚的亲密接触给细菌和真菌提供了佳的湿度和温度环境，脚汗提供了营养，鞋垫提供了油脂。表面菌丝化和微生物的生长会导致鞋材变质，产生令人不愉快的气味，引发感染。对于一些易感染人群这种情况会导致很严重的后果，如糖尿病患者，会导致脚部溃疡甚至截肢。因此避免微生物在脚部和鞋内生长，是目前企业以及消费者关注的焦点。为了解决这个问题，目前切实可行的方法是采用止汗药和含抗菌成分的喷雾直接喷于脚部或鞋内，或者使用吸湿鞋垫减少鞋内的水分。在皮革行业中经常使用化学杀菌剂杀菌，其主要用在加工过程中保护皮坯，但并不能使成革具有抗菌性。此外，由于一些杀菌剂对人体健康和环境造成危害，所以被限制或禁止使用。而对于生态皮革，一些允许使用的特定的杀菌剂的用量，也是有规定的。
现今越来越多的消费者追求卫生健康积极的生活方式，这给制鞋行业带来了不小的挑战。鞋和脚的亲密接触给细菌和真菌提供了佳的湿度和温度环境，脚汗提供了营养，鞋垫提供了油脂。表面菌丝化和微生物的生长会导致鞋材变质，产生令人不愉快的气味，引发感染。对于一些易感染人群这种情况会导致很严重的后果，如糖尿病患者，会导致脚部溃疡甚至截肢。因此避免微生物在脚部和鞋内生长，是目前企业以及消费者关注的焦点。为了解决这个问题，目前切实可行的方法是采用止汗药和含抗菌成分的喷雾直接喷于脚部或鞋内，或者使用吸湿鞋垫减少鞋内的水分。在皮革行业中经常使用化学杀菌剂杀菌，其主要用在加工过程中保护皮坯，但并不能使成革具有抗菌性。此外，由于一些杀菌剂对人体健康和环境造成危害，所以被限制或禁止使用。而对于生态皮革，一些允许使用的特定的杀菌剂的用量，也是有规定的。
到目前为止，只有少量研究抗菌性皮革的文章发表，而且只有一篇是关于将抗菌剂用于鞋材方面的。这其中包括采用氧化锌纳米粒子、银团簇的表面沉积、含茶树油的三聚氰胺－ 甲醛微囊剂以及植物精油，如尤加利、薰衣草和百里香进行处理，或使用含有感光性抗菌剂的聚氨酯分散体涂层等。
壳聚糖是一种线性的天然高分子化合物，化学名为( 1 － 4) － 2 － 氨基－ 2 － 脱氧－ β － D － 葡萄糖，是甲壳素的N － 脱乙酰基的产物。壳聚糖安全、无毒，具有良好的生物相容性和生物降解性，以及独特的成膜性和抗菌性，因而被广泛应用于各个行业。这些特殊的性能使壳聚糖能够作为一种可行的材料，用于皮革功能性涂层的研究中。目前，壳聚糖作为抗菌材料在纺织行业中应用，已经取得了良好的效果。在皮革工业中，壳聚糖及其衍生物主要作为助剂应用于铬鞣染色工段，有关皮革抗菌性的报告，也仅是使用甲基丙烯酸－ 丙烯酰胺－ 壳聚糖共聚物作为抗菌剂。将壳聚糖作为一种新型替代产品应用于抗菌皮革鞋垫，通过3 种不同的涂饰技术( 喷涂、辊涂和转鼓浸渍)考察所得壳聚糖涂饰皮革的抗菌能力。据了解，壳聚糖还从未单独作为抗菌剂应用于制革工业中。此外，随着消费者对天然或天然衍生物溶液需求的不断增长，将会促使制鞋行业发展这类替代品。
1 材料和方法
1． 1 壳聚糖溶液的制备
壳聚糖90 /200 /A1，片状尺寸＜200μm，脱乙酰程度为90． 5%，动态黏度为170mPa·s( 壳聚糖用量为1%，20℃，溶于1% 乙酸溶液中) ，BiologBiotechnologie 股份有限公司( 德国) 生产。取适量壳聚糖分别溶于乙酸和甲酸水溶液中( 2%，v /v ) ，搅拌过夜( 200r /min，50℃) 。选取乙酸是因为在文献中被引用次数多，而选取甲酸是因为甲酸常被应用于制革过程中( 染料固定工序) 。
1． 2 皮样的涂饰
皮样由Aveneda 皮革厂( 葡萄牙)提供，均来自同一批次，经过染色固定后，备用。利用葡萄牙鞋材技术中心的中试系统，对不同处理方法的涂层进行测定，具体如下:
( 1) 喷枪( CEI，葡萄牙工业设备公司) : 壳聚糖溶液( 1%，w/v，乙酸) 。涂饰工序中，使用喷枪在距离皮样14cm 处进行喷涂。
( 2) 辊涂( Zipor，葡萄牙设备和工业技术) : 壳聚糖溶液( 1%，w/v，乙酸) 。在50℃，0 ． 90mm 处连续3 次通过坚硬的压力滚轴辊涂。
( 3) 转鼓浸渍( Zipor，葡萄牙设备和工业技术) : 浸渍温度为50℃，将试验分为以下几个部分: ①分别称取0．5%、1． 0% 和3． 0% 的壳聚糖溶液( 壳聚糖/皮质量比( w/w) ，乙酸水溶液) ，考察壳聚糖含量的不同对涂饰效果的影响; ② 称取1． 0%的壳聚糖溶液( 壳聚糖/皮质量比，w/w) ，分别取2% ( v /v) 乙酸溶液和甲酸溶液，考察不同的酸对涂饰效果的影响; ③称取1． 0%的壳聚糖溶液( 壳聚糖/皮质量比( w/w) ，甲酸溶液) ，浸渍时间分别为1h和2h，考察不同浸渍时间对涂饰效果的影响。涂饰工序结束后，所有皮样在工业条件下干燥，保存在密闭的塑料袋中。同时进行空白试验，把皮样用不含壳聚糖的溶液进行涂饰。
1． 3 抗菌活性试验
试验采用大肠杆菌ATCC 10536。微生物的选取源于前期试验发现壳聚糖对革兰氏阳性菌( 金黄色葡萄球菌) 和革兰氏阴性菌( 大肠杆菌和绿脓杆菌) 具有抗菌作用。研究表明，大肠杆菌是具抗药性的细菌，因此得出的结论更为保守。试验将采用2 种不同的方法: ( 1) 琼脂扩散法，( 2)动态接触条件下的标准试验方法。为了明确获得有效抗菌活性所需要连续周期的次数，对第2 种测试方法进行了改进。第1 次测试作为筛选试验，所有的皮样通过不同的涂饰方法( 喷涂、辊涂和转鼓浸渍) 进行涂饰。第2次测试中，通过辊涂和转鼓浸渍的皮样在标准条件下进行试验，而修正条件下的测试只应用于转鼓浸渍的皮样。
1． 3． 1 琼脂扩散法
该试验采用改进后的AATCC 147测试方法。具体方法: 将4 个菌落无菌转移至营养液体培养基内制备细菌培养液，在( 37 ± 1) ℃ 下培养24h。使用无菌林格液将培养液稀释到0． 5麦氏标准浊度( 相当于浓度为1． 5 ～3． 0 × 108 CFU/mL) 。同时，该细菌稀释液浓度同样通过分光光度测定法( 625nm) 控制。在培养皿中放入无菌接种环和5 个包含营养琼脂的接种管，每个长6cm，间隔1cm，不需要对接种环回填。将皮样( 25mm × 50mm) 横放在5 个接种管中间，保证可与琼脂表面紧密接触。然后将培养皿在( 37± 1) ℃下培养24h。抗菌活性是根据测试皮样边缘是否出现抑菌圈决定的。
1． 3． 2 动态接触条件下的标准试验方法
试验是参照美国试验材料学会标准E 2149 － 01 通用指南进行的。具体方法: 参照1． 3． 1 中的步骤将细菌培养液调节至0． 5 麦氏标准浊度( 相当于1. 5 × 108CFU/mL) ，然后使用无菌林格液将培养液稀释到浓度为1． 5 ～ 3． 0 × 108 CFU/mL。后再使用适量的无菌缓冲液( 0. 3mmol /LKH2PO4，pH 7． 2 ± 0． 1) ，将培养液中细菌悬浮液浓度稀释到终浓度1． 5～ 3． 0 × 105 CFU/mL。为达到评估抗菌活性的目的，将壳聚糖涂膜的皮样( 2cm × 2cm) 放入250mL 无菌烧瓶，加入50mL 浓缩的细菌悬浮液。再将烧瓶放入37℃ 水浴中并搅拌。1min 后取1mL 溶液，使用标准平板计数技术( 在装有营养琼脂的培养皿中使用连续稀释法和琼脂扩散法) 测定细菌浓度，所得到的值就是细菌初接触时间( t0) 的浓度。取样后，将烧瓶立刻放回到水浴中搅拌1h。1h 后再取新的样品进行细菌数量测定。将菌落数目计算值结果转换为菌落数单位( CFU/mL ) ，并计算细菌的减少率( %) 。再取2 个烧瓶，一个加入没有壳聚糖涂层的皮样( 空白试验) ，另一个加入浓缩的细菌悬浮液( 无皮样) ，进行平行试验，同样测定菌落数和细菌减少率( %) 。假设经过1h 搅拌后，壳聚糖涂层样品中的细菌全部消失( 减少率为100%) ，将采用更为精密的采样周期进行试验，如每隔15、30、45 或60min 采样。
1． 3． 3 动态接触条件下的修正试验
修正试验方法在1． 3． 2 中已有介绍，即在动态接触条件下进行试验，在连续周期内获得有效的抗菌活性数目。使用相同的浓缩细菌悬浮液( 1． 5～ 3． 0 × 105 CFU/mL) ，t0时记录细菌浓度。15min 后，将皮样从原来的烧瓶中无菌分离，放入另一个含有50mL细菌悬浮液的烧瓶中，37℃ 水浴下再搅拌15min。对前一个烧瓶中的悬浮液做菌落数量和菌落减少率测定。每隔15min 重复上述步骤，直到总时间为120min( 图1) 。所有细菌数( CFU/mL) 都使用琼脂扩散法，37℃ 下培养24h 后测定。
在给定的时间内，菌落减少量的百分比可通过下面的公式计算:减少量( %) ( CFU/mL ) =
其中，A 指含有样品的烧瓶中的菌落数; B 指只含有接种液的烧瓶中的菌落数。
1． 4 SEM 分析
使用扫描电子显微镜( SEM，配备了5 000V 的背散射电子探测器( BSE) 的Phenom G2 型显微镜( 羿龙世界，埃因霍温，荷兰) ) ，对壳聚糖涂膜的皮样表面形貌进行分析。在不同放大倍率下，使用抑制放电效应样品座，对皮样进行分析检测。
1． 5 评估机械应力和汗渍作用下的牢色度
根据ISO 17700: 2004 标准评估皮革表面经过轻度干湿磨擦后的掉色和色移程度。具体操作: 使用干湿羊毛毡垫分别对皮样擦拭512 和256次，然后将羊毛毡垫上的沾色程度与灰色沾色样卡分别比较评定。根据ISO 11641: 2012 标准评估皮革的耐汗渍色牢度。具体操作:取皮样和一片多纤维帖衬织物( 羊毛、腈纶、聚酯纤维、尼龙、棉和醋酸纤维素) 分别浸渍在人造汗渍溶液中，并放置于真空中。一段时间后，将多纤维帖衬织物和皮样取出，重叠后置于2块玻璃板之间并施压( 180min，( 37 ±2) ℃) 。等干燥后，使用几何分级灰样卡评定皮样的变色和多纤维帖衬织物的沾色程度。
2 结果与讨论
2． 1 转鼓浸渍、辊涂和喷涂方法的评估
考虑到该试验是应用于皮革工业中，壳聚糖抗菌涂层的研究可通过以下2 种方法实现: 综合处理( 即作为附加步骤包含在制革工序中) 或作为皮革衬里的后处理( 图2) 。在第1 种方法中，由于壳聚糖溶于酸性水溶液使其氨基质子化，同时在皮革染色固定中通常使用甲酸固定，因此可以在染色固定工序后( 加脂之前) 附加一步，使用壳聚糖对皮样浸渍，而此时的工艺条件( 包括pH) 也是比较适合。
同时，在染色固定阶段，转鼓内的皮样已处在酸性pH 条件下，制备壳聚糖涂层仅需要加入壳聚糖溶液即可，操作方便且不影响皮革鞣制的整体工序，这从制革工业角度看是非常重要的。而第2 种方法是在后处理工段对皮样进行处理，操作简单，可应用于制革生产中。此外，它也适于生产小尺寸或定制的皮革样品。文中的2 种方法都将应用于小规模试验中: 综合处理中采用转鼓浸渍;后处理采用辊涂法和工业级喷涂法。
