Ξ 李 琪 尾定 诚1 森胜 义2 王如才 (青岛海洋大学教育部海水养殖重点实验室, 青岛, 266003) (1 日本东北大学农学部海洋生物资源教育研究中心, 女川, 98622242) (2 日本东北大学农学部海洋生物系, 仙台, 98128555) 摘 要 利用流水饲养法研究了不同浓度的三丁基氧化锡(0. 5ΛgöL 和 1. 0ΛgöL TBTO ) 对太平洋 牡蛎卵巢中卵母细胞直径、RNA öDNA 比、蛋白质和卵黄蛋白含量的影响。卵母细胞径的增长在 0. 5ΛgöL 实验组受到阻碍, 并随着 TBTO 浓度的增大而更加明显。TBTO 暴露组的RNA öDNA 比 在精巢中无明显变化, 但在卵巢中显著低于对照组。TBTO 暴露组的卵巢中蛋白质和卵黄蛋白含 量显示了与RNA öDNA 比相同的变化趋势, 表明 TBTO 的积累阻碍卵黄蛋白的合成。TBTO 暴露 42d 采集的牡蛎样品中出现 3 个雌雄同体, 暗示 TBTO 可能引起牡蛎发生性转变进而产生雌雄同 体。 关键词 三丁基氧化锡; 太平洋牡蛎; 性成熟 中图法分类号 S944. 4 + 1; X55;Q 25 文章编号 100121862 (2001) 052701206 从 60 年代以来, 包括三丁基氧化锡(T ribu tyltin ox ide, TBTO ) 在内的有机锡化合物作为 有效的附着生物防污涂料, 在船体、渔网上被广泛使用。同时, 由于有机锡化合物是很强的杀虫 剂, 其对海洋生物的毒性影响也有许多报道[1～ 5 ]。在海洋双壳贝方面, 对于有机锡化合物的急 性毒性虽然已经进行了一些研究[3, 6～ 8 ] , 但有关有机锡化合物对贝类生理方面影响的报道却很 少。由于太平洋牡蛎(C rassostrea g ig as) 是一个经济价值高、养殖范围广的种类。近年来, 我们 研究了三丁基氧化锡(TBTO ) 在太平洋牡蛎各个器官的蓄积和排泄特性, 报道了卵巢和精巢 中 TBTO 蓄积快并且排泄缓慢的特点[9 ]。但是, 尚不知道太平洋牡蛎性腺中积蓄的 TBTO 对 其性成熟究竟有何影响。为评价 TBTO 对太平洋牡蛎性成熟的作用, 本文研究了 TBTO 对卵 母细胞发育、卵黄蛋白形成、RNA öDNA 比等生理功能的影响。 1 材料和方法 1. 1 流水饲养实验 处于性成熟期的太平洋牡蛎(软体部重量: (21. 3±5. 9) g; 壳长: (7. 4± 0. 9) cm; 壳高: (10. 9±0. 6) cm ) 于 1994 年 5 月采自日本宫城县松岛湾。牡蛎经过一星期暂养 第 31 卷 第 5 期 2001 年 9 月 青 岛 海 洋 大 学 学 报 JOU RNAL O F OCEAN UN IV ERS ITY O F Q IN GDAO 31 (5): 701～ 706 Sep t. , 2001 Ξ 收稿日期: 2000210216; 修订日期: 2001203208 李 琪, 男, 1966 年 3 月出生, 博士, 教授。 后, 分为 3 个实验组, 每组 80 个, 分别放置于 3 个 120 L 的水族箱中, 并在恒温(20℃) 流水状 态下饲养 42d。3 个实验组的 TBTO (A ldrich Chem ical Company, 美国) 浓度分别设定为 0 (对 照组)、0. 5 和 1. 0ΛgöL , 并在整个实验期间维持其恒定。3d 投喂一次微藻(P av lova lu theri) 培 养液, 密度为 5×10 5细胞ömL。 表 1 TBTO 暴露 42d 太平洋牡蛎的性组成 Table 1 Sex compo sition of the Pacific oysters samp led on day 42 after TBTO expo sure 组别 Group 采集个体数 N um ber 雌性 Fem ale 雄性 M ale 雌雄同体 Herm aph rodite 对照组 Contro l group 14 8 6 0 0. 5ΛgöL 10 5 4 1 1. 0ΛgöL 10 5 3 2 流水饲养实验开始后第 14、28 和 42 d, 从各实验组中分别随机地取 15 个牡蛎, 摘出性腺, 样品分析前置于- 80℃的超低温冰箱中保存。 1. 2 组织学观察 性腺经Bou in 氏固定液固定、石蜡包埋和薄切(6Λm ) 后, 进行苏木精- 曙 红(H ·E) 染色。为确定性发育状况, 从各实验组中分别取 5 个雌性个体的卵巢切片, 在每张切 片上随机的测量 100 个卵母细胞的大直径。 1. 3 核酸分析 100m g 性腺样品在 2mL 的蒸馏水中粉碎后, 取 1mL 用经中野氏修改的 STS(Schm idt2Thannhau ser2Schneider) 法测量DNA 和RNA 含量[10 ]。核酸经乙醇沉淀后, 加 入乙醇2乙醚混合液冲洗数遍。用碱性水解、高氯酸水解分别分离出RNA 和DNA 后, 测量其 在 260 nm 的吸光值以确定RNA 和DNA 的含量。 1. 4 蛋白质定量 100m g 样品的蛋白质浓度用牛血清白蛋白(BSA ) 作为标样, 利用B io2Rad Pro tein A ssay 试剂盒(B io2Rad L abo rato ries, 美国) 进行测定。 1. 5 卵黄蛋白定量 卵巢中的卵黄蛋白相对量利用酶联免疫吸附检测法 (Enzym e2linked imm uno so rben t assay, EL ISA ) 进行测定。100m g 卵巢组织片在 8mL T ris2HCl buffer (含有 2% N aCl, 0. 1% N aN 3, pH 8. 0; TBS) 中粉碎后, 在 25 000×g、4℃的条件下离心 20m in。上清 液用 TBS 稀释后, 分别取 50ΛL 放入 96 孔酶联板中(Sum itomo Bakelite 公司, 日本) , 4℃放置 一夜。用 0. 01mo löL 磷酸食盐水(0. 85%N aCl, pH 7. 2; PBS) 冲洗数遍后, 加入 0. 1%H 2O 2 甲 醇溶液, 放置 30m in。PBS 冲洗数遍后, 向各孔内注入 200ΛL 5% BSA , 4℃放置一夜。太平洋牡 蛎卵黄蛋白抗体经 500 倍稀释后加入各孔内, 室温放置 1h。用含有 0. 2% Tw een 20 的 PBS (PBST ) 冲洗后, 加入 1 000 倍稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG 100ΛL , 室温放置 1h。PBST 冲洗 数遍后, 使用辣根酶基质试剂盒(B io2Rad L abo rato ries, 美国) 测定残留HRP 浓度。卵黄蛋白 的相对含量以所占大值的百分比表示。 2 结果 2. 1 TBTO 对太平洋牡蛎卵母细胞成长的影响 从图 1 可以看出, 随着 TBTO 暴露时间的 702 青 岛 海 洋 大 学 学 报 2 0 0 1 年 延长, 对照组、0. 5ΛgöL 及 1. 0ΛgöL 组的卵母细胞直径虽均呈现增长趋势, 但 TBTO 暴露组低 于对照组。TBTO 暴露 28 d 后, 对照组、0. 5 及 1. 0ΛgöL 3 实验组的卵母细胞直径分别为44. 0、 41. 3 和 36. 9Λm。TBTO 暴露 42 d 后, 对照组卵母细胞直径为 46. 0, 0. 5 和 1. 0ΛgöL 组则为 图 1 TBTO 对太平洋牡蛎卵巢中卵 母细胞直径的影响( 3 P< 0. 05, 与对照组比较) F ig. 1 Effect of TBTO on the oocyte diam eters in the ovary of C rassostrea g ig as. Each value rep resents the m ean ±SE (n= 500) 3 Significantly different from the contro l group (P < 0. 05) 42. 5 和 38. 0, 显著小于对照组(P < 0. 05)。 2. 2 TBTO 对太平洋牡蛎性腺中 RNA öDNA 比率的影响 TBTO 对牡蛎卵巢和精巢的 RNA öDNA 比率的影响结果见图 2。在卵巢中, 随着 TBTO 暴露时间的延长, 各实验组的 RNA öDNA 比率均趋于增长, 但 TBTO 暴露组的增长明显低于对照组。TBTO 暴露 42 d 后, 对照组、0. 5 及 1. 0ΛgöL 组的RNA öDNA 比率依次为 17. 2、13. 4 和 12. 8, 其中 1. 0ΛgöL 组的 值显著小于对照组(P < 0. 05)。与卵巢相比, 在整个实验期间, 各实验组精巢中的RNA öDNA 比率未发生明显变化。 图 2 TBTO 对太平洋牡蛎卵巢和精巢中 RNA öDNA 比率的影响( 3 P < 0. 05, 与对照组比较) F ig. 2 Effect of TBTO on RNA öDNA ration in the ovary and testis of C. g ig as. Each value rep resents the m ean±SE (n= 500). 3 Significantly different from the contro l group (P < 0. 05) 2. 3 TBTO 对太平洋牡蛎卵巢中蛋白质及卵黄蛋白含量的影响 实验期间各实验组的卵巢 中蛋白质含量均有不同程度的增加, TBTO 暴露组的增加幅度低于对照组。TBTO 暴露 42d 后, 对照组、0. 5 及 1. 0ΛgöL 组的蛋白质含量分别为 72. 4、60. 0 和 55. 1, 其中 1. 0ΛgöL 组的蛋 白质含量显著小于对照组(P < 0. 01, 图 3)。各实验组的卵黄蛋白量随实验时间的延长也都趋 于增长, 其中对照组的增加量高于 TBTO 暴露组, 呈现与蛋白质量一致的变化趋势。TBTO 暴 露 42 d 后, 0. 5ΛgöL 组的卵黄蛋白量为对照组的 78% , 而 1. 0ΛgöL 组的卵黄蛋白量则只有对 照组的 61% , 显著小于对照组(P < 0. 01, 图 3)。 2. 4 TBTO 对太平洋牡蛎性组成的影响 表 1 表示TBTO 暴露 42d 后采自各实验组的太平 洋牡蛎的性组成。在 0. 5ΛgöL 组, 10 个个体中有一个雌雄同体, 在 1. 0ΛgöL 组, 10 个个体中有 两个雌雄同体(图 4) , 而在对照组中则未发现。 5 期 李 琪, 等: 三丁基氧化锡(TBTO ) 对太平洋牡蛎性成熟的影响 703 图 3 TBTO 对太平洋牡蛎卵巢中蛋白质含量和卵黄蛋白相对含量的影响( 3 3 P < 0. 01, 与对照组比较) F ig. 3 Effect of TBTO on the p ro tein content content and relative vitellin content in the ovary of C. g ig as. Each value rep resent the m ean±SE (n= 5). 3 3 Significantly different from the contro l group (P < 0. 01) 图 4 TBTO 暴露第 42d 采自 1. 0ΛgöL 实验组的雌雄同体 牡蛎的性腺切片(×200) (OC, 卵母细胞; SC, 精母细胞) F ig. 4 H isto logical section of the herm aph roditic gonad of C. g ig as samp led from the 1. 0 ΛgöL group on day 42 after TBTO expo sure (×200). OC, oocytes; SC, sperm atocytes 3 讨论 在本研究中, 性成熟期的太平洋牡蛎卵母细胞直径的增长在 0. 5ΛgöL TBTO 实验组即受 到阻碍, 并随着 TBTO 浓度的增大而更加明显。由于卵黄蛋白的积累是太平洋牡蛎卵母细胞 成长的主要原因[11 ] , 因而卵母细胞径增长受抑制暗示, TBTO 有可能阻碍卵黄蛋白的合成。 由于 RNA 直接参与蛋白质的合成而每个个体的组织体细胞细胞核中DNA 含量又是固 定的, 因此RNA öDNA 比在许多动物组织中都作为蛋白质合成活性的指标[12, 13 ]。在本实验中, TBTO 暴露组的RNA öDNA 比在精巢中无明显变化, 但在卵巢中显著低于对照组。各实验组 精巢 RNA öDNA 比变化不显著是由于牡蛎性成熟期间精巢中蛋白质合成不活跃[14 ] , 而 TBTO 暴露组卵巢RNA öDNA 比的降低则表明 TBTO 可能抑制了卵巢中蛋白质的合成。 在 TBTO 暴露组的牡蛎卵巢中, 蛋白质和卵黄蛋白含量显示了与RNA öDNA 比相同的 变化趋势, 表明卵黄蛋白是卵巢蛋白质的主要成分, TBTO 的积累阻碍了卵黄蛋白的合成。在 海洋双壳贝方面, 有关有机锡化合物对性成熟影响的报道很少。 在鱼类方面, 虾虎鱼经 1. 99ΛgöL 的 TBTO 暴露 24 周后, 出现肝细胞显著坏死, 卵黄积累受到阻碍[15 ]。刺鱼在 0. 19～ 0. 99ΛgöL 的 TBTO 中暴露 7 个月后, 观察到退化变性卵增加, GSI(生殖腺体重比) 增长受到 704 青 岛 海 洋 大 学 学 报 2 0 0 1 年 抑制[16 ]。 实验进行第 42d 采自 TBTO 暴露组的牡蛎样品中观察到 3 个雌雄同体。尽管样品数量较 少, 但由于在对照组中未发现雌雄同体, 因而可以推测 TBTO 可能引起牡蛎发生性转变进而 导致产生雌雄同体。Do lgov 报道了在中国南海石油污染的环境压力可能诱导珠母贝发生性转 变[17 ]。在新腹足目贝类, 人们很熟悉有机锡化合物(TBT ) 可以诱导雌性个体产生交接器、输精 管 等雄性生殖器官 (即 impo sex 现象) [18～ 21 ]。通过对雌性犬峨螺 (N ucella lap illus) 的研究, Spooner 等推测导致这一现象的原因是由于 TBT 阻碍了芳香化酶(arom atase) 的活性而抑制 了睾丸激素向 17Β2雌二醇转变的生化过程[22 ]。