菌、藻类以及软体动物在海上建筑、船只和器材上的附
着，所以主要用于防附着的防污漆。常用的有三丁基
氧化锡、三丁基氟化锡和三苯基氯化锡等。由于它们
的毒性强，对生物的伤害极大，因而在使用过程中极易
造成环境污染。迄今为止，有机锡是人为引入海洋环
境中毒性大的物质之一。它可干扰海洋动物体内激
素的分泌，造成生殖和遗传方面的不良后果。大量研
究表明，有机锡能影响鱼、虾、贝类等多种生物正常变
态，降低幼体成活率，干扰代谢过程，产生“性畸变”，严
重时造成种群衰退[‘“伙还能成为生物的神经毒素，引
起胸腺萎缩和四肢变异等[“5]。而有机锡对藻类毒性
效应的报道主要集中在微藻方面[““]。关于有机锡对
大型海藻的研究很少，曾有报道对孔石药的生理生长
的影响[[ 9]。
紫菜是潮问带及沿岸海域人工养殖经济价值高
的海藻。本实验通过研究三丁基氧化锡((TBTO)对坛
紫菜体细胞生长的影响，评价有机锡对紫菜的毒性效
应，探讨应用紫菜养殖进行海洋环境修复的可行性。
1材料和方法
1.1实验材料
白然生长的坛紫菜幼嫩叶状体，2003年11月采白
浙江象山，叶状体长度2 } 5 cm，在良好的通风状态下
阴干8h，使其含水量在30%左右，冷冻保存于一20℃
的冰箱里。
三丁基氧化锡，购白F luka公司，为无色透明液
体，纯度98%。
1.2实验方法
1.2.1培养紫菜纯种叶状体将坛紫菜从冰箱中取
出，放入消毒海水中，于20℃复苏24 h。选取复苏后
的单棵优良坛紫菜，除去边缘生殖细胞，参照戴继
勋[ion等描述的方法，以酶解法制备原生质体。将紫菜
切成2 mm2大小，加入已稀释的海螺酶,1%的纤维素酶
R-10和2 mol/ L的葡萄糖，酶解2h。用筛绢(300目)
过滤，将滤液用消毒海水洗涤、离心，以去除残留
的酶液。收集原生质体，放入加有N, P的消毒海水培
养液中培养，并定期更换培养液。培养条件:20光
强:30 l}mol 0m一 2 0s-1，光周期12L 012D0 40 d后收集
长出的叶状体，用同上方法进行酶解、培养，即可获得
紫菜纯种叶状体。
1.2.2 TBTO培养液配制参考TBTO对单细胞藻
和动物的一些研究，再通过预实验的观察，确定实验所
用的浓度梯度为0.25, 0.5, 1, 2, 4 nmol/L。现用现配。
1.2.3坛紫菜细胞活性鉴定将坛紫菜纯种叶状体
酶解，制得原生质体。用Evans-blue对原生质体进行
染色，未着色者为存活细胞，染成深蓝色者为死亡细
胞。在培养过程中，细胞的死亡以其色素消褪和细胞
解体为标准。
1.2.4细胞培养取纯种细胞，用吸管吸取少量海
水培养液，轻轻吹打，使细胞均匀分布，将其平均注入6
个培养皿中，分别编号。再加入已经配好的0.25, 0.5,
1, 2, 4 nmol/L的TBTO培养液，另设一组不加TBTO
的消毒海水作为对照。培养12 h后全部换成培养液，
以后每日更换培养液。
1.2.5细胞观察用记号笔在每个培养皿底部均匀
分散点10个点，分别对应10个显微镜视野，统计10
个视野中活细胞的平均数，记为初始细胞平均数。每
日进行观察，选择视野中色素体清晰的细胞计数，单细
胞或多个细胞形成的个体作为1个记数单位。统计各
培养皿中个体的存活状况，色素恢复程度及形态，细胞分
裂时问，发育形成的正常苗、畸形苗和多细胞团比率。
细胞存活率-10个视野存活的细胞平均数/初始
细胞平均数。
正常苗比率一正常苗平均数/存活个体平均数。
畸形苗比例一畸形苗平均数/存活个体平均数。
本实验为5次重复实验的平均数。各试验组结果
与对照组之问的差异显著性用t检验进行分析。
2结果及分析
2. 1 TBTO对坛紫菜细胞色素体的影响
培养开始后，在普通显微镜下观察，细胞的色素体
颜色浅绿，呈不均匀分布的弥散状态(见图2>。放入培
养液中培养1d后，色素体便开始恢复，终变为深紫
红色的辐射星状或深绿色分布均匀的块状。培养2 d,
坛紫菜单细胞在不同浓度TBTO刺激下，色素体的恢
复状况见表to
由表1 uJ一以看出.培养2 d. TBTO浓度为
0. 25 nmol/ L的培养液中.色索体完全恢复的白分率与
对照组差异不大(P> 0. OS >, 0. 5 nmol/ L的浓度组则
有显一著差异(PG0.05>.而其’已各浓度组差异均极为显
一著(P>0.01)。这表明浓度0 . 5 nmol/ L的TBTO对
坛紫菜细胞色索体的恢复有显一著的抑制作川J。
随着TBTO浓度的增大，色索体的形态也发生变
化，星状色索体所.片的比率越来越低，与对照组相比均
有显一著差异(PG0.05>。实验表明.TBTO能加速坛紫
菜细胞的衰退过程。
2.2 TBTO对坛紫菜细胞存活率的影响
不同浓度的TBTO培养液对坛紫菜离体细胞存活
率的影响(见图1)
如图1所小，各培养组的细胞存活率都随时间变
化而下降。培养lOd，对照组中细胞存活率约为82 0 o,
其’已各组均低于对照组，表现出明显的毒性效应(尸<
0.01)。在添加了0. 25 nmol/ L不I I 0. 5 nmol/ L TBTO
的培养液中，前3d细胞存活率的下降幅度差别不大，
而其它3个浓度组，则变化较大，特别是4 nmol/ L的
浓度组.培养到第5天.细胞便全部死亡(见图3>0
在同‘时间范围内，细胞存活率均随浓度的增}}uJ
而下降，A. i'u}浓度组的细胞存活率下降更为明显。以
浓度的‘}i川l对数为横坐标，各组细胞存活率的概率单
位为纵坐标，绘制生民效应曲线，通过直线回归法计
算，uJ得出TBTO对坛紫菜细胞72 h的半数致死浓度
(LC;o }}z n)约为1. 9 nmol/ L o
2.3 TBTO对坛紫菜细胞生民的影响
TBTO对坛紫菜细胞生民速度的影响见表20
由表2 uJ一知·0 . 25 nmol/ L的TBTO在初始培养的
3d内.其2细胞个体比率.uJ于对照组(P} 0. OS >,表明
低浓度TBTO对细胞分裂有促进作川Ji随后3细胞及)
4细胞个体比率开始下降，明显低于对照组(尸<
0 .OS)。
在培养6d后，3细胞及)4细胞比率均随TBTO
浓度的升.uJ而降低.目_与对照组相比有极显一著差异
(P}0.O1 >,表明TBTO对坛紫菜细胞的生民都有抑
制作川J，特别是4 nmol/ L的浓度组，培养到Sd时全部
细胞都少匕分裂现象。
在观察过程中还发现，在培养到第9天以后，从对
照组到各浓度组均有部分未分裂的单细胞，1. TBTO
浓度越.}uJ，单细胞所II比率越大。
2.4 TBTO对坛紫菜细胞发育的影响
根据观察，坛紫菜叶状体营养细胞的发育方向不
尽相同，有的通过极性分裂，细胞一分为二，1个细胞分
化为假根(见图4)，另一个细胞经多次横纵分裂形成正
常细胞苗(见图5);也有的发育成不完整的畸形苗，不
具真正的假根，叶片基部数个含色素体的细胞呈乳头
状突起，构成一至数个类假根(见图6>;但大部分细胞
是经多次分裂形成多细胞团(见图7)0
坛紫菜叶状体营养细胞在不同浓度TBTO中的发
育状况见表
由表3可知，当TBTO浓度低于0. 5 nmol/ L时，
均在第3天长出假根，说明低浓度TBTO对假根生成
的影响不大，而高浓度组则明显延缓假根的生成过程。
当培养到第6天时，在0 . 25 nmol/ L的TBTO中，
其正常苗的生成比率要稍高于对照组CPG0.05)，其它
各浓度组则明显低于对照组(PG0.01)，尚未见畸形苗
出现。但随着时问的增长，0. 25 nmol/ L的浓度组正常
苗比率开始下降，畸形苗比率则显著上升(PG0.05),
其它各浓度组也均是畸形苗比率明显高于正常苗比率
CPG0.05)，这说明TBTO对紫菜细胞具有极强的致
畸变作用(见图8)。并且0 . 5 nmol/ L以上的浓度组，
其总的成苗率与对照组之问存在极显著差异(尸<
0. O1)，表明较高浓度的TBTO能够抑制细胞成苗。而
TBTO对细胞团的影响较为缓慢，但长时问的刺激也
会畸变细胞团及团内细胞色素体的形态(见图9>0
3讨论
本实验先获得纯种叶状体，保证了酶解所得原生
质体的遗传性状相同，消除了因紫菜品系不同而带来
的细胞发育差异;然后选取无生殖细胞的叶状体部分
进行酶解，保证所得全部为营养细胞，消除了生殖细胞
而带来的计数误差，从而提高实验的精确度和可信性。
实验结果表明，低浓度CG 0 . 25 nmol/ L)的TBTO
与对照组相比在短时问内能够促进坛紫菜体细胞分裂
和生成正常苗。李正炎、高尚德等[6}]在研究有机锡对
微藻的生理功能的影响时也发现这一现象。Steb-
binge 11}认为这种增益现象是生物抵抗不良环境的生理
反应或代谢补偿过程，是生物白我保护的一种机制。
但随着时问的延长这种刺激作用则会转变为抑制作
用，可能是因为在TBTO刺激下，毒害和降解2个过程
同时存在，而培养初期，降解过程占主导地位，但随着
紫菜细胞对TBTO的富集，毒害过程则逐渐占据主导，
从而扣J制细胞的分裂。而高浓度C> 0 . 6 !}g/ L)的
TBTO能够抑制坛紫菜细胞色素体恢复，阻止细胞分
裂，畸变细胞形态，加速细胞衰亡等。
此外，研究中发现，无论是对照组，还是浓度组，均
有部分细胞白始至终不发生分裂，这可能是部分酶解
细胞受到损伤，短时问还不能恢复到正常状态。同时
还发现，污染物浓度越高，单细胞所占比率也就越大，
这可能是因为高浓度暴露减弱了环境中其它因素的影
响，并加强了对细胞的抑制作用。
到目前为止，有机锡对海洋藻类的报道主要集中
在单细胞微藻，研究多侧重于有机锡对单细胞藻生理
生化指标的影响，以及各种单胞藻半数抑制浓度的比
较和富集能力的测定等。而有机锡对藻类毒性机理的
研究则相对较少，其作用机制还没有完全解释清楚。
现有结果证实，有机锡具有高脂溶性，易进入细胞膜，
与之牢固结合，阻碍膜上正常物质传递，并在细胞内高
度累积，进而影响生物正常的生理功能，导致生物体内
一些基本新陈代谢过程不可逆的被破坏。
本研究与李钧等[”]研究的大型海藻孔石药的实验
结果相比较，发现紫菜处理的时问短、剂量低，用
4 nmol/ L的TBTO处理12 h，转入正常培养，完全抑制
了细胞分裂，到第5天，则全部死亡。由此看来，紫菜
对TBTO的反应要较孔石药敏感得多。但是，由于
TBTO污染严重的地区，其浓度也在1 nmol/ L之下，
而且紫菜的育苗养殖技术也较孔石药成熟，因此应用
紫菜养殖来修复受污染海区还是可行的。
